王颖 1 , 肖雪 1 , 李丹 1 , 钟春燕 1 , 范翔 2 , 李刚锐 2 , 孟尧 1
  • 1. 成都医学院检验医学院(成都 610500);
  • 2. 四川大学生命科学学院/生物资源与生态环境教育部重点实验室(成都  610064);
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目的研究重组产朊假丝酵母尿酸酶的高效表达条件、分离纯化和部分酶学性质。方法选择在菌体对数生长末期加入诱导剂,通过摇瓶培养对异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)和乳糖诱导产酶的效果进行比较;利用 50 L 发酵罐研究诱导培养时间;通过 Ni-琼脂糖凝胶柱亲和层析、Sephacryl S-200 HR 层析纯化目的蛋白并研究其最适 pH 值和酸碱稳定性、最适温度及热稳定性。结果摇瓶培养结果显示乳糖诱导效果优于 IPTG。发酵罐培养工程菌,在对数生长末期添加乳糖诱导 7 h 后酶活力和生物量均达到最大值,分别为 164 U/g 菌体和 23 g 菌体/L 发酵液,即每升发酵液含酶活性 3 772 U。纯化的尿酸酶比活性为 4.5 U/mg,其最适 pH 值为 7.5,最适温度 40℃,酸碱稳定范围在 pH 值 6.0~10.0,温度低于 45℃ 时热稳定性较好。结论以乳糖作为诱导剂培养效果更佳;带有 His 标签的重组尿酸酶经 Ni-琼脂糖凝胶柱亲和层析和 Sephacryl S-200HR 分子层析后即可获得纯品,纯化流程更为简单;该纯化酶的最适反应温度、最适 pH 值、酸碱稳定性和热稳定性的确定为其结构与功能的关系以及未来的实际应用提供了一定的实验依据。

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